رنگ آمیزی باکتری ها

[آرما]

رنگ آمیزی باکتری ها:
قسمت اول:
نحوه آماده سازی لام جهت رنگ آمیزی
1-تهیه گسترش:
گسترش میکروبی ممکن است از محیط کشت مایع یا جامد تهیه شود ابتدا بر روی یک لام ساده و تمیز یک قطره آب مقطر یا سرم فیزیولوژی قرار می دهیم. فیلدوپلاتین را استریل کرده (بوسیله شعله ) و سپس با قرار دادن آن در کناره محیط کشت جایی که فاقد باکتری باشد خنک می کنیم. بوسیله فیلدوپلاتین حلقوی ازسوسپانسیون ,باکتری برداشت کرده روی لام قرار می دهیم و آن را پخش می کنیم. باید توجه داشته باشیم که در محیط های جامد کلنی باکتری را از منطقه 4 پلیت برداشت کنیم.کلنی باکتری را بوسیله فیلدوپلاتین در داخل آب پخش می کنیم. لامل را تحت زاویه 45 درجه بر روی لام قرار می دهیم. یک گسترش خوب گسترشی است که بعد از خشک شدن بر سطح لام یک لایه نازک سفید ظاهر شود.
2-خشک کردن گسترش:
لامی را که به طریقه بالا تهیه شده است را در معرض هوا یا در مجاورت گرما قرار می دهیم تا گسترش روی لام خشک شود.
3-ثابت کردن (فیکساسیون):
جهت ثابت کردن از حرارت مستقیم استفاده می کنیم.البته باید دقت کرد که حرارت آنقدر زیاد نباشد تا عناصر سلولی و میکروبها سوخته و غیر قابل تشخیص گردند و آنقدر هم کم نباشد که میکروبها ثابت نشوند.
برای ثابت کردن لام خشک شده را سه مرتبه از بالای شعله عبور می دهند و هر بار باید مقدار حرارت به قدری باشد که پشت دست را نسوزاند.در مواردی که با ساختارهای حساس باکتری مانند کپسول و تاژه کار می کنیم این مرحله حذف می شود.
نکته : برای تهیه گسترده از محیط کشت مایع ابتدا لوله را به آرامی تکان می دهیم تا باکتری های ته نشین شده را در محیط پخش کنیم.
نکته: گسترش را به اندازه 4/1 سطح لام پخش می کنیم.
انواع رنگ آمیزی :
رنگ آمیزی ساده : جهت مشاهده شکل و مورفولوژی باکتری و آرایش آنها
رنگ آمیزی افتراقی :
1-رنگ آمیزیهای متداول :
رنگ آمیزی گرم
رنگ آمیزی اسید فست



2-مشاهده ساختمان های مختلف :
رنگ آمیزی کپسول
رنگ آمیزی اسپور
رنگ آمیزی هسته
رنگ آمیزی تاژه

رنگ آمیزی ساده :
برای مقایسه شکلها و بررسی آرایش سلولهای باکتری است .در رنگ آمیزی ساده ترجیحا از رنگهای بازی (کروموژن با بار مثبت ) استفاده می شود زیرا اسیدهای نوکلئیک و ترکیبات خاص دیواره دارای بار منفی بوده و با کروموژنهای کاتیونیک پیوند برقرار می کنند.متداولترین نوع رنگهایی که در این نوع رنگ آمیزی استفاده می شود عبارتند از:
متیبن بلو, کریستال ویوله و کربول فوشین
ادامه دارد

[آرما]

قسمت دوم
مراحل انجام کار رنگ امیزی ساده:
1-تهیه گسترش از باکتری مورد نظر
2- خشک کردن گسترش در مجاورت هوا
3- فیکسه کردن گسترش در مجاورت هوا
4- ریختن چند قطره رنگ متیلن بلو یا کریستال ویوله یا کربول فیشن برای 1 تا 2 دقیقه
5- شستشوی گسترش با آب به منظور خارج کردن رنگ اضافی از روی لام
6- استفاده از کاغذ جهت خشک کردن گسترش
7- بررسی میکروسکوپی
در طی مرحله 4 لام را باید به صورت افقی و در مرحله 5 باید لام را به صورت موازی با جریان آب نگهداشت.
در این نوع رنگ آمیزی برحسب نوع رنگ بکار برده شده میکروب ها به سه رنگ مختلف دیده می شوند:
رنگ آبی (متیلن بلو )
رنگ بنفش (کریستال ویوله )
رنگ قرمز(کربول فوشین )
رنگ آمیزی گرم :
یکی از متداول ترین رنگ آمیزی ها در آزمایشگاه میکروبشناسی می باشد که نخستین بار کریستین گرم در سال 1884 این روش را ابداع نمود و باکتری ها را به دو گروه اصلی تقسیم کرد:
باکتری گرم منفی و باکتری گرم مثبت
مراحل رنگ آمیزی گرم:
مراحل 1تا 3 را انجام می دهیم.
4-افزودن رنگ اولیه :
در این مرحله رنگ کریستال ویوله افزوده می شود به مدت 1دقیقه
5-سشتشو با آب
6- افزودن محلول لوگول که یک محلول تثبیت کننده است به مدت 1 دقیقه
7-شستشو با آّب
8-افزودن محلول رنگ بر ( الکل – استن )
این عامل دو عمل را انجام می دهد:
الف)حلال چربی است.
ب) دهیدراته کننده پروتئین ها است.
9-شستشو با آب
10-اضافه کردن رنگ سافرانین یا فوشین به مدت 30 تا 60 ثانیه
12-شستشو با آب
13- خشک کردن
در رنگ آمیزی گرم باکتری گرم مثبت به رنگ بنفش و باکتری گرم منفی به رنگ صورتی دیده می شود.
رنگ آمیزی منفی باکتری ها:
در این رنگ آمیزی باید از رنگ های اسیدی مانند مرکب چین یا هندی و یا نیگروزین استفاده کرد.رنگ های اسیدی با داشتن کروموژن با بار منفی قادر به نفوذ به درون سلول نمی باشد زیرا بار الکتریکی سطح سلول باکتری ها نیز منفی می باشد.بنابراین در این نوع رنگ آمیزی سلول های بدون رنگ باکتری در زمینه رنگی به سادگی قابل شناسایی است.
این نوع رنگ آمیزی بررسی باکتری هایی را که به سختی رنگ می گیرند را ممکن می سازد.در این روش عمل ثابت کردن گسترش توسط حرارت لازم نیست و سلولها در معرض اثرات خاص مواد شیمیایی و حرارت قرار نمی گیرند بنابراین اندازه و شکل سلول ها به صورت طبیعی مشاهده می شود.
ادامه دارد

[آرما]

قسمت سوم :
مواد لازم و روش تهیه رنگ برای رنگ آمیزی منفی:
مرکب هندی یا چین,مرکب رسم پلیکان شماره 17 جهت آزمایش پیشنهاد می شود.به عنوان محافظ 3/0% تری کروزول به آن می افزاییم.
روش رنگ آمیزی :
در روش رنگ آمیزی با مرکب هندی,کپسول ذرات کلوئیدی کربن مرکب را جذب کرده و در نتیجه به صورت یک هاله شفاف اطراف میکروارگانیسم مشاهده می شود .این روش برای مشاهده کپسول پنومونیه توصیه می شود.
1- یک قطره رنگ نیگروزین یا مرکب هندی را در یکی از دو انتهای لام قرار دهید.
2- یک لوپ پر از باکتری های مورد نظر را در قطره رنگ وارد کنید و با فیلدوپلاتین رنگ و باکتری ها را با هم مخلوط کنید.
3- یک لام دیگر برداشته و روی قطره رنگ حاوی باکتری ها قرار داده و بوسیله آن گسترش را آماده کنید.
خشک کردن گسترش و میکروسکوپی آن.
تفسیر رنگ آمیزی :
در این رنگ آمیزی باکتری ها بیرنگ , شفاف و در زمینه ای سیاه رنگ مشاهده می شود.

مشاهده ساختمان های مختلف باکتری :
1)رنگ آمیزی کپسول:
کپسول یک لایه ژلاتینی خارجی است که از سلول ترشح شده و آن را احاطه کرده و به دیواره سلولی متصل است.تمامی میکروارگانیسم ها قادر به تولید کپسول نمی باشد .سلول هایی که کپسول ضخیم دارند عموما بیماریزا می باشند زیرا این ساختمان باکتری را در مقابل عمل فاگوسیتوز سلول های میزبان محافظت می کند.
مراحل رنگ آمیزی کپسول _ روش جینز (jins ) :
1-تهیه گسترش از باکتری کپسول دار مانند کلبسیلا پنومونیه (Klebsiella pneumoniae )
2-خشک کردن گسترش در مجاورت هوا
3-اضافه کردن رنگ کریستال ویوله 2% به مدت 1 دقیقه
4-بسرعت آن را با جریان ملایم آب بشویید.
5-افزودن اسید استیک 1-2 % به مدت 10 ثانیه
6-شستشو لام با جریان ملایم آب
7- خشک کردن
8-مشاهده میکروسکوپی
در این روش جسم رویشی باکتری به رنگ آبی و کپسول به رنگ صورتی کمرنگ دیده می شود.
توجه :
لازم به ذکر است که در رنگ آمیزی کپسول نیازی به مرحله فیکس کردن به وسیله حرارت نیست زیرا حرارت سبب کوچک شدن سلول و ایجاد هاله شفاف کاذب می شود که ممکن است با کپسول اشتباه شود.
2)رنگ آمیزی اسپور :
اسپور حالت مقاوم سلول رویشی باکتری است . بعضی از باکتری ها در شرایط نامساعد محیط قابلیت تشکیل سلول مقاوم از سلول رویشی را دارند که در این حالت چون در درون سلول رویشی تشکیل می شود به آن اندوسپور گفته می شود هنگامیکه این فرم از سلول خارج می گردد به آن اسپور گفته می شود .
اسپور به دلیل داشتن پوششهای غیر قابل نفوذ در برابر شرایط نامساعد همچون کمبود رطوبت و دما و نور,
امواج رادیویی , مواد شیمیایی, انجماد, خشکی مقاوم می باشد.
اسپور زایی یک مرحله زایشی در چرخه سلول باکتری به حساب نمی آید بلکه یک مرحله استراحت (کمون ) بوده که در آن متابولیسم سلول غیر فعال شده و شرایط نامساعد را تحمل می کند.در صورت مساعد شدن شرایط اسپور قادر است به فرم رویشی تبدیل شود که این عمل طی سه مرحله انجام می شود عبارتند از:
فعال شدن ,جوانه زدن,تبدیل اسپور به فرم رویشی
مراحل رنگ آمیزی اسپور به روش مالاشیت گرین:
1-انجام مراحل 1 تا 3
4-افزودن رنگ مالاشیت گرین به مدت 10-15 دقیقه همراه با حرارت
سه نکته باید توجه شود:
ü رنگ خشک نشود.
ü رنگ نجوشد.
ü در صورت تبخیر مرتبا رنگ اضافه شود.
5-شستشو با آب
6-افزودن رنگ زمینه (سافرانین ) به مدت 1 – 2دقیقه
در این مرحله سلول های رویشی رنگ قرمز به خود می گیرند و به رنگ قرمز – صورتی دیده می شوند ولی اسپورها سبز دیده می شوند.
7- شستشو با آب
8- خشک کردن
9-مشاهده میکروسکوپی
ادامه دارد